Презентація на тему:
ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН ТКАНИН ТА ЗМІНИ ВМІСТУ ІОНІВ НАТРІЮ ЗА УМОВ ПАТОЛОГІЧНОЇ ГІПОКСІЇ ТА КАНЦЕРОГЕНЕЗУ

ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН ТКАНИН ТА ЗМІНИ ВМІСТУ ІОНІВ НАТРІЮ ЗА УМОВ ПАТОЛОГІЧНОЇ ГІПОКСІЇ ТА КАНЦЕРОГЕНЕЗУ Aндрій M. Бабський Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика

Мета роботи Вивчити механізми участі іонів Na+ при патологічних відхиленнях за умов: ішемії міокарду діабетичної кардіоміопатії канцерогенезу Розробити неінвазивну методику моніторингу рівня іонів Na+ у пухлині для оцінки ефективності лікування раку за допомогою: гіпертермії хіміотерапії

Для досягнення поставленої мети необхідно було дослідити: Зміни градієнту Na+ та їх вплив на біоенергетичні процеси за умов діабетичної кардіоміопатії Роль іонів Na+ у позитивному ефекті коротких гіпоксійних тренувань на післяішемійне відновлення функцій серця Вплив високих температур на внутрішньоклітинний рівень іонів Na+, клітинний ацидоз та біоенергетику ракових клітин фібросаркоми Зв’язок між змінами параметрів дифузії води, зовнішньо- та внутрішньоклітинного Na+, біоенергетичним статусом та структурними змінами у ракових пухлинах за умов їх росту та при хіміотерапії

Методи Загально-тканинний Na+ (Na+т): одно-квантові (ОК) переходи 23Na-ЯМР (in vivo) Внутрішньо- та зовнішньоклітинний Na+ (Na+в та Na+з): спектроскопія 23Na-ЯМР із реагентами зсуву (in vitro) потрійно-квантові (ТКФ) переходи 23Na-ЯМР (in vivo) Коефіцієнт дифузії води (КДВ): дифузійно-градієнтні зображення 1Н-ЯМР Біоенергетичний статус і рН: полярографія і 31Р-ЯМР Гліколіз: позитронно-емісійна томографії Структура тканин: гістологія та диструктивний хімічний аналіз

Розділ 1. Зміни градієнту Na+ та їх вплив на біоенергетичні процеси за умов діабетичної кардіоміопатії

9 8 Брукер АМ-400 CO 2 + O 2 6 5 3 4 2 1 CO 2 + O 2 7 Схема експерименту ЯМР із суперфузованими клітинами Пробірка для ЯМР (ø10 мм) Фільтр (ø10 мкм пори) Клітини в агарозних кульках Стандарт (MФК і TmДОТФ) Установка для ЯМР Спектрометер Суперфузійний розчин Tермостат Газовий балон

50 60 70 80 90 100 0 2 4 6 8 10 12 NaCl, мM * * * Швидкість дихання при фосфорилюванні АДФ, відносні зміни Контроль Діабет Вплив різних концентрацій іонів Na+ на дихання та окисне фосфорилювання у контрольних та діабетичних мітохондріях (МХ) серця щура М ± m, n = 5. * - P 0,05 (Контроль vs. Діабет). Швидкість дихання без NaCl приймали за 100%. Зростання [Na+]в у діабетичних кардіоміоцитах на 5 – 10 мМ викликало порушення окисних процесів та синтезу АТФ в МХ: зменшення швидкості поглинання кисню мітохондріями у метаболічному стані 3 на 45 – 50% зменшення швидкості окисного фосфорилювання на 54 – 58% У контрольних МХ інгібуючі ефекти Na+ були вірогідно менш вираженими Babsky et al. Exp. Biol. Med., 2001

Полярографія: M ± m, n = 5. * - Р < 0,05 (Контроль vs. Діабет); ** - Р < 0,05 (NaCl з CaCl2 vs. NaCl без CaCl2); *** - Р < 0,05 (NaCl, 3 мM vs. NaCl, 0 мM). ЯМР: M ± m, n = 4. * - Р < 0,05 (Діабет vs. Контроль). Зростання [Na+]в у кардіоміоцитах діабетичних щурів на 5 – 10 мМ викликало порушення процесів синтезу АТФ в МХ У МХ контрольних тварин інгібуючі ефекти Na+ були вірогідно менш вираженими Зростання [Na+]в призводило до зменшення концентрації Са2+ у МХ кардіоміоцитів діабетичних тварин шляхом активації Na+/Са2+-обміну Дилтіазем (250 мкМ) повністю блокував інгібуючий ефект іонів Na+ на дихання та швидкість окисного фосфорилювання (ШОФ) у МХ Babsky et al. Exp. Biol. Med., 2001 Вплив іонів Na+ на дихання та окисне фосфорилювання у мітохондріях (МХ) серця контрольних та діабетичних щурів 40 60 80 100 0 10 20 30 ATФ / Фн, відносні зміни Na, мM * * * * - Дилтіазем + Дилтіазем Контроль Діабет 0 10 20 30 Na, мM 31Р-ЯМР Полярографія 0 3 3 3 NaCl (мМ): СaCl2 (мкМ): 0 0 35 114

Розділ 2. Роль іонів Na+ у позитивному ефекті коротких гіпоксійних тренувань на післяішемійне відновлення серця

Схема перфузійної системи ізольованого серця за О. Лангендорфом 1. Ізольоване серце щура, 2. Порівняльний стандарт (108мМ МФК і 10мМ TmДОТФ5-), 3. ЯМР-пробірка ( 20 мм), 4. Установка для ЯМР (Брукер 9,4 T), 5. Розчин Кребса-Генселейта, 6,7. Водяні термостати (37 оС), 8. Прилад для реєстрації серцевого тиску і частоти скорочення серця, 9. Газова суміш (95% СО2/5% О2), 10. Система підтримання температури (37 оС). напрямок руху перфузійного розчину, напрямок циркулювання води (37 оС). Схема експериментів за вивчення впливу кортких гіпоксійних сеансів (КГС) на рівень Na+в та інші метаболічні показники ізольованого перфузованого серця щура -80 -60 -40 -20 0 20 40 Контроль КГС КГС сеанси Перфузія Зупинка перфузії РЗ I IV V Час, хв С т а б і л і з а ц і я Ішемія Реперфузія IІ IІІ 4

0 10 20 30 Серцевий тиск (mmHg) Контроль Група КГС * ** Три 5-и хв КГС Ішемія Реперфузія зупинка перфузії 5 хв 30 хв 6 6,2 6,4 6,6 6,8 7 Вихідний рівень (ВР) ВР2 КГС Ішемія Реперфузія рНв Контроль Група КГС * ** *** **** M ± m, n = 6 (Контроль) і 5 (КГС). * - Р < 0,05, ** - Р < 0,01 (Контроль vs. групи КГС). М ± m, n = 5. * – Р 0,001 (КГС vs. BР2), ** – Р 0,002 (Контроль: Ішемія vs. BР2), *** – p 0,01 (Контроль: Реперфузія vs. Ішемія), **** – p 0,04 (група КГС: Реперфузія vs. Ішемія). ВР – вихідний рівень. Вплив КГС на відновлення скорочувальної функції та рНв після 30-и хвилинної ішемії серця ЧСС: 253 / 249 271 / 229 189 / 229 Внутрішньоклітинне рН Тиск у серцевому шлуночку КГС сприяли швидшому і повнішому відновленню скорочувальної функції серця та обмеженню клітинної ацидифікації Babsky et al. Exp. Biol. Med., 2002

Зміни внутрішньоклітинного Na+ протягом різних метаболічних стадій у перфузованому серці 10 5 0 -5 PPM 1хв Naв Naз Стандарт Naт Розмежування піків ЯМР Na+з і Na+в після додавання TmДOTФ5- (3,5 мМ) 10 хв 13 хв 16 хв 19 хв 22 хв М ± m, n = 6 (Контроль) і 4 (група КГС). * - Р < 0,01 (Контроль vs. групи КГС), **- Р < 0,01 (vs. доішемійного рівня у кожній групі), *** - Р < 0,05 (Група КГС: vs. закінчення ішемії). ВР – вихідний рівень. КГС призводили до зростання активності Na+/Н+-обмінника, який залишався активованим протягом ішемії та на початку реперфузії * ** ** *** Babsky et al. Exp. Biol. Med., 2002

Розділ 3. Вплив гіпертермії на внутрішньоклітинний Na+, біоенергетичний статус та рН у суперфузованих ракових клітинах RIF-1

100 120 140 160 0 20 40 60 80 Час перфузії клітин, хв ГТ 37 oC * * * * † 42 °C 45 °C 37oC * * * * * * * * Внутрішньоклітинне рН 6,8 7 7,2 7,4 37 oC 0 20 40 60 80 45 oC 37 oC * * Час перфузії клітин, хв † Внутрішньоклітинний Na+, відносні зміни Na+в рНв Зміни Na+в та рНв у суперфузованих клітинах RIF-1 за впливу гіпертермії (ГТ) М m, n =4. Початковий рівень Naв+ приймали за 100%. Затінення відображають період стабілізації температури у ЯМР-пробірці. Вірогідність: * - Р ≤ 0.05 (vs. початкового рівня), †- Р ≤ 0.05 (vs. 42 oC). ГТ із 45 оС викликала незворотнє зростання Naв+ на 55-60% та зворотнє зменшення рНв Babsky et al. Int. J. Hyperthermia, 2005

Наведено співвідношення кількості колоній до кількості висіяних клітин 37 oC Контроль 45 oC Гіпертермія, 30 хв Вплив ЕІПА та монензину на здатність клітин RIF-1 утворювати колонії за умов гіпертермії Бабський, Клевець, Банзал. Вісник Львів. ун-ту, 2007 Контроль 116/480 = 0,24 360/11000 = 0,033 EIПA 105/305 = 0,34 267/11800 = 0,023 Монензин 144/370 = 0,39 25/17600 = 0,0014

Діабетична кардіоміопатія Ішемія Енергетичний дефіцит Гіпоксія Na+/Ca2+ у МХ Na+в Поглиблення енергетичного дефіциту Активність Ca2+-залежних ферментів у МХ Схематичне зображення ключової роль іонів Na+ у моніторингу різних патологічних станів збільшення (активування) зменшення (пригнічення) Na+/K+- АТФаза КГС Додаткове Na+/H+ Помірне Na+/H+ рНв Зменшення енергетичного дефіциту Післяішемійне відновлення роботи серця

Розділ 4 А. Методи реєстрації 23Na-ЯМР та дифузії води в експериментах in vivo для ранньої неінвазивної діагностики ефективності лікування ракових пухлин Моделі підшкірних (п/шк) пухлин RIF-1 і гліоми 9L

1H (КДВ) градієнтний імпульс 10 мс (затримка 40 мс) ПЯЗ 40 40 експериментальні точки 256 128 16 ЯМР-перетинів товщина перетину 0,5 мм відстань між перетинами 1,5 мм ЧП = 1,1 с ЧE = 60 мс b-фактори 0, 236, 945 & 1679 с/мм2 час 19 хв ОК 23Na ( тканинний Na+) РЧ-імпульс 90-100 мкс експериментальні точки 64 32 8 ПЯЗ 40 40 36 16 ЯМР-перетинів товщина перетину 2 мм ЧП = 50 мс ЧЕ = 10 мс широта сигналу 3,7 кГц час 14 хв Томографія ЯМР в експериментальних пухлинах TКФ 23Na (внутрішньоклітинний Na+) РЧ-імпульс 90-100 мкс експериментальні точки 64 32 8 ПЯЗ 40 40 36 16 ЯМР-перетинів товщина перетину 2 мм ЧП = 120 мс ЧE = 10 мс час 50 хв Горизонтальна установка для ЯМР (Варіан 9,4 Т, 31 см, Паоло Альто, США)

Протипухлинні препарати, що використовували у роботі: Циклофосфамід (ЦФ) 1,3-bis(2-хлоретил)-1-нітросечовина (БХНС) 5-фторурацил (5ФУ)

Вплив ЦФ на об’єм п/шк пухлин RIF-1 Об’єм пухлини вірогідно зменшувався на 2- та 3-й день після ін’єкції ЦФ * Об’єм пухлини, мм3 1 1,5 * ** 0 1 2 3 Дні після терапії Вірогідність: * P 0,05 (vs. до терапії), ** P 0,01 (Контроль vs. ЦФ). n = 5 (Контроль) i 6 (ЦФ) Контроль ЦФ (3-й день) Контроль ЦФ ЦФ Babsky et al. Neoplasia, 2005

Контроль ЦФ 0 1 2 3 Дні після терапії із ЦФ 23Na КДВ 23Na КДВ У пухлинах RIF-1 інтенсивністьсигналу 23Na-ЯМР та КДВ зростали на другий та третій день після терапії із ЦФ Типові зображення 23Na-ЯМР та мапи КДВ без (Контроль) і після терапії п/шк пухлин RIF-1 із ЦФ Babsky et al. Neoplasia, 2005

Вплив БХНС на об’єм, КДВ та тканинний Na+ у п/шк пухлині гліоми 9L Вірогідні зміни із * Р 0,05 позначені зірочками Підвищення рівня Na+т було притаманне стадії росту гдіоми, а не стадії його зупинки після лікування з БХНС Зупинка росту гліоми супроводжувалась зменшеним рівнем Na+т та КДВ порівняно до контрольної гліоми або у випадку резистентності пухлин до БХНС Високий початковий рівень Na+т, а також КДВ (1,2 – 1,3 × 10-3 мм2/с) може слугувати прогностичним критерієм для ефективного лікування із БХНС Babsky et al. J. Magn. Res. Imaging, 2007 - 1 1 3 5 ** ** * * 1 2 1.5 * * * Коефіцієнт дифузії води, 10-4 мм2/сек Об єм пухлини, см3 БХНС * *** * * * ** ** *** 8 10 12 14 16 80 100 120 140 160 180 *** *** *** *** БХНС * - vs. День -1 ** - ЧБХНС vs. Контроль - * 1 2 1.5 Контроль ЧБХНС HЧБХНС БХНС 23Naпухлина / 23Naстандарт, Відносні зміни *** - vs. День 1 * - vs.День -1 ** - ЧБХНС vs. Контроль *** - ЧБХНС vs. НЧБХНС Дні після терапії 1 3 5 -1 Дні після терапії 1 3 5 -1 Дні після терапії Об’єм КДВ Na+т

80 100 120 140 ТКФ 23Na, відносні зміни * * 0 1 2 3 Дні після терапії 5ФУ 0-й день 1-й день 2-й день 3-й день Контроль 5ФУ Вірогідність: Р 0,05 (* - vs. 1-й день) Сигнал TКФ-23Na-ЯМР зростав у контрольних пухлинах, залишаючись відносно стабільним у пухлинах після терапії із 5ФУ Вплив 5ФУ на внутрішньоклітинний Na+ у п/шк пулинах RIF-1 ЯМР ТКФ-23Na Контроль, n = 9 5ФУ, n = 7 Babsky et al. Magn. Reson. Imaging, 2007

ЗКС Na+т ( vs. контроль) КДВ ( vs. контроль) БХНС Відмирання клітин гліоми 9L Зупинка росту пухлини ДГЗ 1H Схема моніторингу рівня іонів Na+ для контролю ефективності хіміотерапевтичного лікування ракових пухлин експериментальних тварин збільшення зменшення без змін Na+/K+ - ATФаза Швидкість гліколізу Постачання кисню pHв Біоенергетика Зсув від гліколізу до ОФ Na+/H+ обмін ПET ТКФ-23Na Na+в ( vs. контроль) 31P-ЯМР Бабський, Банзал. Експ. клін. фізіол. біохім., 2006

Розділ 4 Б: Моніторинг росту ортотопної та підшкірної гепатоклітинної карциноми (ГКК) за допомогою методів 23Na- і 1H-ЯМР Моделі ортотопної та підшкірної ГКК

0,6 1,0 1,4 1,8 10 15 20 25 Дні після інокуляції КДВ, 10-3 мм2 / c ГКК Печінка ГКК / печінка * * * Ортотопна ГКК *** *** *** M ± m, n = 5 – 7. Вірогідність: * P < 0,05 (vs. HCC), ** P < 0,05 (vs. 7-й день (ортотопна ГКК) чи 14-й день (п/шк ГКК)), *** P < 0,01 (ортотопна ГКК vs. п/шк ГКК). Ортотопна ГКК: Вже на 7-й день після інокуляції КДВ був вищим, ніж у суміжній тканині печінки З ростом пухлини її КДВ помірно зменшувався Співвідношення КДВ пухлини і печінки залишалось незмінним на рівні 1,4 – 1,5 * ** Коефіцієнт дифузії води: ортотопна ГКК vs. підшкірної ГКК 15 20 25 Дні після інокуляції ГКК M’язи ГКК / м’язи * * * ** ** ** Підшкірна ГКК Підшкірна ГКК: На 14-й день після інокуляції КДВ був у 2,8 разів меншим, ніж в ортотопній ГКК і у два рази – ніж у суміжній тканині м’язів На 21- і 28-й дні КДВ вірогідно збільшувався У той самий час КДВ у м’язах не змінювався КДВ у п/шк пухлині був вірогідно нижчим, ніж в ортотопній Бабський та ін. Укр. біохім. журн., 2008; Вісник Львів. у-ту, 2009

Зображення 23Na-ЯМР в ортотопній та підшкірній ГКК 14 21 28 Дні після інокуляції ГКК Нирка Стандарт Печінка 7 ОК-23Na-ЯМР TКФ-23Na-ЯМР Підшкірна ГКК Ортотопна ГКК ГКК Печінка ОК-23Na-ЯМР TКФ-23Na-ЯМР ОК- і ТКФ- 23Na-ЯМР виявили зростання загального тканинного і внутрішньоклітинного Na+ у ГКК в обох місцях розташування TКФ-23Na-ЯМР був навіть чутливіший до змін, що супроводжують ріст ГКК Бабський та ін. Вісник Львів.ун-ту, 2009

23Naт сигнал КДВ Розташування пухлини [Na+]з 23Naв сигнал [Na+]в Фізіологічний рух органів очеревини КД-Na+ ВКС ВКС Перфузія органу Переваги 23Na-ЯМР перед КДВ (1Н ДГЗ) за моніторингу метаболічних та функціональних змін за умов канцерогенезу органів очеревини та його лікування ЗКС

Положення, які виносяться на захист: Неінвазивний моніторинг градієнту Na+ у плазматичній мембрані є важливим засобом для з’ясування механізмів розвитку гіпоксійних станів за різноманітних патологій Метод 23Na-ЯМР можна успішно використовувати для ранньої діагностики та оцінки ефективності терапії канцерогенезу

Висновки Діабетична кардіоміопатія: Підвищення рівня Na+в в результаті пригнічення роботи Na+/K+-помпи Активація Na+/Ca2+-обмінника у мітохондріальній мембрані Зниження синтезу АТФ в результаті пригнічення активності Са2+-залежних дегідрогеназ циклу Кребса Короткі гіпоксійні сеанси у перфузованому серці: Швидше і повніше відновлення механічних функцій серця протягом післяішемійної реперфузії Активацію Na+/Н+-обмінника плазматичної мембрани Зменшення закислення внутрішньоклітинного середовища у кардіоміоцитах протягом тривалої ішемії

Гіпертермія ізольованих клітин RIF-1: Зростання Na+в в результаті активування Na+/H+-обміну у плазматичній мембрані Зворотнє зменшення рНв та біоенергетичного статусу Зростання термочутливості за впливу Na+-іонофору монензину за незалежним від рН механізмом Висновки (продовження)

Хіміотерапія п/шк пухлин RIF-1 За умов контрольного росту пухлин: Стабільні значення КДВ та Na+т Зростання Na+в Терапія із ЦФ і 5ФУ: Вірогідне і швидке зменшення об’єму пухлин Зростання КДВ і Na+т , які корелювали між собою Обмеження зростання Na+в, яке не корелювало із змінами Na+т Зменшення поглинання ФДГ Збільшення ЗКС за рахунок зростання некротичних зон та зменшення щільності клітин у пухлині Висновки (продовження)

Гепатоклітинна карцинома: Зміни КДВ у ГКК, що росте у печінці і під шкірою відрізняються в результаті впливу руху печінки на ортотопну пухлину ЯМР ОК- і ТКФ-23Na не спотворюється рухом органу і може фективно використовуватись для оцінки структурних і метаболічних змін у ГКК незалежно від її розташування Висновки (продовження)

Дякую за увагу!