Презентація на тему:
Високоефективна рідинна і тонкошарова хроматографія

Лекція 15 Високоефективна рідинна і тонкошарова хроматографія доц. Л.В. Вронська

План Теоретичні основи рідинної хроматографії ВЕРХ – високоефективна рідинна хроматографія ТШХ – тонкошарова хроматографія Паперова хроматографія

Теоретичні основи рідинної хроматографії Рідинна хроматографія – це метод розділення і аналізу складних сумішей, в якому рухомою фазою є рідина. Передумови виникнення і застосування: Речовини з великою молярною масою Нелеткі речовини Термічно нестійкі речовини Іоногенні речовини

Теоретичні основи рідинної хроматографії РХ базується на адсорбції з розчину. Адсорбційна рівновага між розчином і адсорбентом узгоджується з рівнянням ізотерми адсорбції Ленгмюра, в області розведених розчинів ізотерма лінійна. Селективність адсорбції залежить від природи сил взаємодії між адсорбованими речовинами і адсорбентом. H = 2Rr(1 – Rr)Uts,

Теоретичні основи рідинної хроматографії Рідинна адсорбційна хроматографія нормально-фазова полярний адсорбент неполярна рухома фаза обернено-фазова неполярний адсорбент полярна рухома фаза

Теоретичні основи рідинної хроматографії !!! Вибір рухомої фази завжди важливіший, ніж вибір нерухомої. Нерухома фаза повинна утримувати розділювані речовини. Рухома фаза, тобто розчинник, повинна забезпечити різну ємкість колонки і ефективне розділення за оптимальний час. Нерухома фаза – пористі тонкодисперсні матеріали з питомою поверхнею більше 50 м2/г.

Теоретичні основи рідинної хроматографії Нерухомі фази Полярні: SiO2, Al2O3, MexOy, флоросил, а також з привитими полярними групами (–NH2, - ОН, діоли) Неполярні: графітована сажа, кізельгур, диатоміт.

Теоретичні основи рідинної хроматографії Полярні нерухомі фази для розділення: неполярних, малополярних і середньої полярності речовин Неполярні нерухомі фази: - не мають селективності до полярних молекул Вказані сорбенти наносяться на поверхнево-пористі носії

Теоретичні основи рідинної хроматографії Рухома фаза Від неї залежить: селективність розділення; ефективність колонки; швидкість руху хроматографічної смуги.

Теоретичні основи рідинної хроматографії Вимоги до рухомої фази: повинна розчиняти досліджувану пробу; мала в’язкість (коефіцієнти дифузії D компонентів проби достатньо високі); можливе виділення з неї розділюваних компонентів; інертна по відношенню до матеріалів всіх частин хроматографа; відповідає вимогам вибраного детектора; безпечна; дешева. !!! Як було сказано, елююча сила рухомої фази – розчинника впливає на розділення.

Теоретичні основи рідинної хроматографії Елююча сила розчинника показує, у скільки разів енергія сорбції даного елюенту більша, ніж енергія сорбції елюенту, вибраного в якості стандарту, наприклад, н-гептану. Розчинники (елюенти) ділять на слабкі і сильні. Слабкі елюенти мало адсорбуються нерухомою фазою, тому коефіцієнт розподілу D сорбата високий. Сильні елюенти сильно адсорбуються нерухомою фазою, тому коефіцієнт розподілу D сорбованих речовин (сорбата) низькі.

Теоретичні основи рідинної хроматографії Наприклад: SiO2 – нерухома фаза. Сила розчинників збільшується в ряду: пентан (0) CCl4 (0,11) C6H6 (0,25) CHCl3 (0,26) CH2Cl2 (0,32) ацетон (0,47) діоксан (0,49) ацетонітрил (0,5) етанол метанол.

Теоретичні основи рідинної хроматографії Розміщення розчинників у відповідності із зростанням їх елюючої сили називають елюотропним рядом. В рідинній адсорбційній хроматографії елюотропний ряд Снайдера має вигляд: пентан (0) н-гексан (0,01) циклогексан (0,04) CCl4 (0,18) бензол (0,32) CHCl3 (0,38) ацетон (0,51), етанол (0,88) вода, СН3СООН (дуже велика).

Теоретичні основи рідинної хроматографії Для обернено-фазової хроматографії на С18 елюотропний ряд має вигляд: метанол (1,0) ацетонітрил (3,1), етанол (3,1) ізопропанол (8,3) н-пропанол (10,1) діоксан (11,7).

Теоретичні основи рідинної хроматографії Методи елюювання: ізократичне елюювання – склад рухомої фази постійний метод ступінчатого або градієнтного елюювання – склад рухомої фази за спеціальною програмою змінюється: в процесі хроматографування послідовно застосовують все більш сильні елюенти. Переваги ступінчастого елюювання: підвищення ефективності розділення скорочення часу аналізу – скорочується час утримування сильно утримуваних компонентів

Теоретичні основи рідинної хроматографії Існують емпіричні правила, які допомагають при виборі елюенту. Сорбція, як правило, зростає із збільшенням числа подвійних зв’язків і ОН-груп в сполуках. Сорбція зменшується в ряду органічних сполук: кислоти спирти альдегіди кетони складні ефіри ненасичені вуглеводні насичені вуглеводні.

2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ)

2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) Рідинний хроматограф фірми

2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) У ВЕРХ обидві контактуючі фази – НФ і РФ – рідини. Метод розподільчої, або рідинно-рідинної хроматографії базується на розподілі речовини між двома фазами, які не змішуються, подібно зводиться до багатократної ступінчастої екстракції. Розділення компонентів базується на відмінностях їх коефіцієнтів розподілу між НФ і РФ.

2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) нормально-фазова розподільча хроматографія нерухома фаза: звичайно полярний розчинник (вода, спирт) фіксований на твердому носії – силікагелі, діатоміті, целюлозі, Al2O3. рухома фаза: неполярні розчинники – ізооктан, бензол і т.д. Такі системи використовують в.

2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) обернено-фазова розподільча хроматографія Нерухома фаза: неполярний розчинник зафіксувати на носії рухома фаза: полярні розчинники (вода, спирт, буферні розчини, сильні кислоти)

2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) Рідкі нерухомі фази “пришивають” до носія. В якості носіїв нерухомих рідких фаз для нормально-фазової розподільчої хроматографії використовують силікагелі з пришитими нітрильними, амінними та ін. групами. В обернено-фазовому варіанті розподільчої хроматографії використовують силікагелі з привитими алкілсилильними групами від С2 до С22 (часто застосовуваними фазами є фази з пришитими С18).

2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) Головні вузли рідинного хроматографа: система подачі рухомої фази (насос, дегазатор, система для створення градієнту концентрації рухомої фази, вимірювачі тиску). рух.ф. = 0,1 – 10 мл/хв р = до 400 атм. система введення проби (дозуюча петля); колонка в термостаті; (10, 15, 25 см з діаметром 4-5,5 мм) (5-6 см і діаметром 1-2 мм); детектор; реєструючий пристрій.

2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) (статус дисплея керуючого комп’ютера)

2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) Статус насоса, інжектора виводяться на дисплей хроматографа

2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) Статус детектора – діодної матриці, виводиться на дисплей хроматографа (УФ - лампа)

2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) Положення зразків в автосамплері

2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) Автосамплер забезпечує автоматичний відбір аліквот з попередньо підготовлених і поданих проб)

2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) Насос з дегазатором рідинного хроматографа фірми

2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) Ручне введення проби зразка мікрошприцом через дозуючу петлю. Поруч розміщені термостат з колонкою, детектор

2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) Загальний вигляд хроматограми (три компоненти)

2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) Детектори: диференціальні рефрактометри – достатньо універсальний детектор (чутливість ~ 10–6 г); УФ-детектор (10–9 г) (254 нм); фотометричні і спектрофотометричні; діодна матриця (УФ- і видима ділянка спектру при будь-якій довжині хвилі); флуоресцентні для виявлення токсинів. Мікробіологічних об’єктів, вітамінів (більш чутливі в 100 разів); кондуктометричний для іонної та іонообмінної хроматографії (0,01 мкг/мл – 100 мг/мл).

2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) Якісний аналіз (ДФУ): порівняння часів утримування досліджуваної речовини у випробуваній пробі й розчині порівняння (стандартний розчин цієї ж речовини) – найчастіше використовується; порівняння відносних часів утримування аналізованої речовини у випробуваній пробі й розчині порівняння (стандартний розчин цієї ж речовини) – застосовується, коли можливе невідтворення умов хроматографування; порівняння хроматограми випробуваної проби з хроматограмою розчину порівняння або з хроматограмою, наведеною в окремій статті (для препаратів рослинного і тваринного походження).

2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) Для кількісного визначення визначають площі піків чи висоти піків (ДФУ): висоти дозволяють рахувати тільки при ізократичному режимі хроматографування і при коефіцієнті асиметрії 0.8-1.2. площі піків обов’язково рахувати при градієнтному елююванні. Кількісний аналіз (ДФУ) основного компоненту: абсолютне калібрування метод внутрішнього стандарту.

2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) Кількісний аналіз (ДФУ) домішок: кількісне визначення домішки з використанням розчину порівняння з відомою концентрацією домішки; метод внутрішньої нормалізації; порівняння з розведеним розчином основної речовини; метод стандартних добавок (для підвищення точності можливе використання методу внутрішнього стандарту).

2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) При методиці обов’язково зазначають: параметри колонки (розміри, сорбент, комерційна марка, розмір часток нерухомої фази); температуру колонки; швидкість і склад нерухомої фази; тип детектора.

2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) Тест „Придатність хроматографічної системи”: відносні часи утримування зазначених речовин мають бути близькими до зазначених величин; число теоретичних тарілок, розраховане для зазначеного піка, має бути не менше зазначеної величини; коефіцієнт розділення зазначених піків, розрахований з хроматограм розчинів порівняння (стандартних), має бути не менше зазначеної величини; відносне стандартне відхилення висоти чи площі піку (або їх відношень до висоти чи площі піку внутрішнього стандарту) за результатами 5 хроматографувань має не перевищувати зазначену величину; коефіцієнт симетрії зазначеного піку, розрахований з хроматограми (стандартного) розчину порівняння, має бути в межах, зазначених в окремій статті.

3. ТШХ – тонкошарова хроматографія Сорбційні властивості системи в ТШХ розраховуються з експериментальних даних за рівнянням для фактору рухливості: чи відносного фактору рухливості:

3. ТШХ – тонкошарова хроматографія На Rf впливають фактори: якість і активність сорбенту; волога сорбенту; товщина шару сорбенту; якість розчинника.

3. ТШХ – тонкошарова хроматографія Число теоретичних тарілок n Висота, еквівалентна теоретичній тарілці Коефіцієнт розділення в тонкому шарі сорбенту Kf

3. ТШХ – тонкошарова хроматографія Сорбенти в ТШХ: силікагелі; оксид алюмінію; крохмаль; целюлоза та деякі інші речовини з високою адсорбційною здатністю. ТШХ: висхідна; низхідна; кругова чи горизонтальна. Підложки для сорбенту (пластинки): скло: алюмінієва фольга; поліефірна плівка. Вибір розчинників залежить від: природи сорбенту; властивостей досліджуваних речовин.

3. ТШХ – тонкошарова хроматографія По закінченню хроматографування зони на хроматограмах проявляють фізичним чи хімічним способами. Фізичний спосіб – УФ-світло чи лічильники радоактивності (фотоматеріали – папір чи плівки). Хімічний спосіб – проявка хроматограми через обприскування розчином реактиву

3. ТШХ – тонкошарова хроматографія Основні елементів пристроїв та деталей для ТШХ: камера із сумішшю розчинників; хроматографічні пластинки (Мерк, Силуфол, Сорбфіл); пристрій для нанесення або мікрошприц чи калібрований капіляр; пристрій для детектування хроматограм – лампа для УФ- світла при 254 і 365 нм; пристрій для зрошування хроматограм розчинами різних реагентів; камера для висушування хроматограм; сканер для оцінки інтенсивності плям на хроматограмах чи радіоактивні лічильники.

3. ТШХ – тонкошарова хроматографія Лампа для проглядання хроматографічних пластинок в УФ-світлі фірми

3. ТШХ – тонкошарова хроматографія Проявка хроматограми в УФ-світлі після обробки з автоматичного пульверизатора

3. ТШХ – тонкошарова хроматографія Якісний аналіз в ТШХ при ідентифікації (ДФУ): Порівняння плями досліджуваної речовини і стандартної речовини - повинні бути однакові за забарвленням (колір флуоресценції), розміром і величиною утримування (Rf) Перевірка придатності ТШХ-пластинок: стандартна суміш індикаторів: судан червоний G, бромкрезоловий зелений, метиловий червоний і метиловий оранжевий система розчинників: метанол Р – толуол Р (20:80). Коли фронт розчинників пройде дві третини довжини пластинки, вона вважається придатною, якщо на хроматограмі буде чітко 4 розділених плями із строго зазначеними значеннями факторів рухливості

3. ТШХ – тонкошарова хроматографія Кількісний аналіз: безпосереднє визначення на пластинці за допомогою вимірювання пропускання або відбиття світла, флуоресценції (фотоденситометри). безпосередньо на пластинці або на окремих розрізаних смугах пластинок за допомогою лічильників радіоактивності. зняттям нерухомої фази, розчиненням сорбату у відповідному розчиннику чи сцентиляційному коктейлі й вимірювання відповідного фізичного показника чи радіоактивності отриманого розчину.

4. Паперова хроматографія випадок площинної рідина-рідинної розподільчої хроматографії, яка базується на розділенні речовин, що відбувається за рахунок різниці розчинності у рухомій фазі і нерухомій фазі (вода у порах паперу). Варіанти паперової хроматографії: висхідна; - низхідна; - кругова. Якісний аналіз – як в ТШХ. Кількісний аналіз: візуальна оцінка – порівняння інтенсивності забарвлення плям; оцінка площ плям; вирізання плями і зважування плям досліджуваного зразка і стандартної речовини; елюювання речовин з плям і наступне визначення відповідним фізико-хімічним методом.