Презентація на тему:
clon1

Гетерогенність та основи клонування клітин в культурах -Постійні клітинні лінії, які експлантовані з певної тканини, характеризуються тим, що вони складаються з клітин певного генезу -Клітинна однорідність створюється на ранніх етапах культивування -В якості селектуючого для культивування клітин виступає середовище культивування

Гібридизація соматичних клітин з послідуючою сегрегацією геномів може проходити спонтанно в культурах клітин, що приводить до обміну генетичною інформацією між клітинами популяції, проте частота цих явищ надзвичайно мала і тому постійні клітинні лінії можна розглядати не тільки, як популяції клітин одного тканинного типу, але і як популяцію, в межах якої відсутній обмін генетичною інформацією В популяціях в культурі основні параметри зміни структури обумовлені двома основними процесами: а)виникненням спадкових змін в соматичних клітинах (ПРОЦЕС МІНЛИВОСТІ) б) диференціальним розмноженням клонів, спадково відмінних між собою (ПРОЦЕС ВІДБОРУ)

Популяції соматичних клітин багатоклітинного організму поділяються на ростучі; (КЛІТИНИ В КУЛЬТУРІ) ті які відновлююються; стаціонарні Люба постійна клітинна лінія шляхом клонування може бути розчленована на потомство окремих клітин Здатність формувати клони притаманна не всім клітинам, а лише певній їх частині, тобто “клоногенним” клітинам. Клоногенними вважаться клітини, які на 10-у добу культивування формують колонії з числом клітин 100 та більше (ФЕРТИЛЬНА СУБПОПУЛЯЦІЯ КЛІТИН) Більшість дрібних колоній, які входять в склад клітинної популяції втрачають здатність до поділу, а фракції цих клонів не можна субклонувати (АБОРТАТИВНА СУБПОПУЛЯЦІЯ КЛІТИН)

Величина субпопуляції клоногенних клітин тим більша, чим кращі умови культивування. Мінливість клітинних популяцій залежить не лише від мінливості клоногенних фракцій, але і від мінливості клітин, які втратили здатність до поділу. Каріотипова варіабільність в межах клоногенних клітин завжди вужча, аніж в межах цілої популяції. Гетерогенність популяції соматичних клітин виникає як наслідок цілого ряду ознак: 1) знаходженню клітин на різних стадіях клітинного циклу, поза циклом та на різних стадіях цитодиференціювання 2) із-за виникнення в клітинах спадкових змін 3) із-за неоднорідності умов, що оточують окремі клітини Спадкова мінливість клітин в популяції включає: -генотипові зміни (зміна кількості, якості та порядку розташування авторепродуктивних матриць клітини – поза залежності від ядерної та цитоплазматичної локалізації) епігеномні зміни, обумовлені блокуванням та деблокуванням генетичного матеріалу

При зміні умов культивування клітин в культуріведучою формою відбору стає прогресивна. Найбільш чітко дія прогресивної форми проявляється при селекції ліній та клонів на стійкість до несприятливих умов середовища. Таким чином, основні показники, які визначають генотипову та фенотипову структуру популяції клітин в культурі не є за своєю природою постійними. Поліпшення умов культивування приводить до зниження частоти спадкової гетерогенності. Популяційні характеристики клітинних ліній також залежать від їхнього походження (тканинного та видового). Наприклад, в популяції клітин перещеплюваних ліній мінливість та спадкова гетерогенність значно перевищує таку в популяції нормальних клітин. Різноманітність властивостей неопластичних клітин, які виникають із популяції нормальних клітин може обумовлюватись декількома причинами відмінностями у материнських нормальних клітин різним ступенем генетичних змін відбір варіантів з додатковими постгенетичними змінами.

Різні нормальні клітини, які належать до однієї і тіє ж тканини, можуть відрізнятись: За ступенем диференціювання за позиційною інформацією. подібні генетичні зміни двох нормальних клітин, можуть приводити до різноманітності властивостей неопластичних клітин. Селекція є важливим фактором, що підвищує гетерогенність властивостей неопластичних популяцій Неопластичні популяції клітин на відміну від нормальних характеризуються підвищеною здатністю до утворення генетично відмінних варіантів клітин та підвищеною селекцією цих варіантів. При прогресії неопластичних клітин в популяції накопичуватись три типи клітин з додатковими змінами: клітини, у яких ступінь неопластичної трансформації виражена сильніше, чим у вихідної популяції клітин. Клітини із ізолбованими змінамиокремих трансформованих ознак, тобто клітини, у яких додатково більш виражена якась із ознак фенотипових проявів (наприклад, розпластання) Клітини з різними мутаціями, що міняють ознаки, не пов’язані безпосередньо з ознаками, характерними для трансформації

Основні механізми виникнення клітинної гетерогенності пухлин. А)природнім джерелом виникнення гетерогенності пухлин поліклонального походження є гетерогенність нормальних клітин- попередників. Окрім цього так званого нормального механізму, клітинна гетерогенність має свої специфічні механізми, серед яких виділяють 4 основні групи: -генетична нестійкість пухлинних клітин -епігеномні механізми -диференціація (коли диференціюються стовбурові клітини, які здатні проліферувати) -злиття пухлинних клітин

Зміна властивостей неопластичної популяції клітин називається прогресією. По Фулдсу (1969), прогресія є незворотньою якісною зміною однієї або декількох властивостей неоплазії. Основні правила прогресії 1.Незалежна прогресія множинних пухлин: прогресія різних пухлин, які виникають у однієї тварини, їде незалежно одна від іншої. 2.Незалежна прогресія ознак: прогресія різних властивостей однієї і тієї ж пухлини йде незалежно (характер васкуляризації, метастатичний потенціал) 3. Прогресія не залежить від росту: прогресії можуть підвергнутись не тільки ростучі пухлини, але і ті пухлини ріст яких призупинився. Важливим наслідком правила 3 є те, що стадія прогресії, на якій знаходиться виявлена у людини дана пухлина, не залежить від її розміру чи тривалості клінічного протікання 4. Прогресія може бути поступовою або лавиноподібною. 5.Прогресія може йти декількома альтернативними шляхами 6.Прогресія не завжди доходить до кінця раніше, чим настає смерть організму, в якому розвивається пухлина.

Одним із важливих напрямків дослідження субпопуляційних характеристик клітин в популяціях нормальних та трансформованих клітин є клонування та реклонування Клонування клітин можна проводити за різними типами ознак: генотиповими; фенотиповими структурними морфологічними функціональними за здатністю до формування певних тканиноподібних структур за здатністю до диференціювання За здатністю експресувати певні поверхневі маркери і т.д.

Клонування клітин по наявності певного класу метаболітів або характерних метаболічних шляхів. Для отримання таких клонів в більшості випадків використовується чергування в перещепленні клітин на тварини певних ліній in vivo та послідуюче клонування за певною ознакою з використанням селективних умов мікрооточення in vitro. Так, клон GH1, який було виділено із пухлини гіпофізу MtT/W5 селективно секретував гормон росту та призводив до підсилення росту тварин при перещепленні цього клону. Клон І-10, клітини якого секретували прогестерон та його похідні 20-альфа-окси-4-прегнен-3-он в культуральне середовище було виділено із пухлини клітин Лейдига Н10119, яка послідовно може бути клонована шляхом перещеплення на мишей лінії Balb/cI. Метод клонування клітин з певною функцією застосовується і для нормальних клітин, штам клітин щитовидної залози щурів (клітини FRTL) секретують в культуральне середовище тіроглобуліни, підвищуючи концентрацію іодідів в 100 раз. Для культивування цих клітин використовується спеціальне середовище, яке містить інсулін, тиреотропін, трансферин, гідрокортизон, соматостатін і невеликий відсоток сироваптки 0,1-0,5%. Низький вміст сивороткових факторів є критичним на ранніх етапах відбору клітин за функціональною ознакою. - При отриманні міогенних клітинних ліній мишей та щурів в якості біохімічного маркеру використовують питому активність креатінінфосфокінази. -

- Клітини MCF-7 можуть бути клоновані в щільному моношарі за здатністю під дією естрадіолу, утворюючи куполоподібні структури, які функціонально можуть належати до епітелію, що вистилає залози - Клонована лінія BeWo із трофобластних клітин людини, які отримані із злоякісної хоріонкарциноми, здатні продукувати цілий ряд плацентарних гормонів – хоріонічний гонадотропін, лактоген, та стероїди (естрон, естрадіол, естріол, прогестерон) Тобто, клонування клітин за функціональною ознакою, тобто здатністю до секреції певних метаболітів, може бути використано: для клонування певного типу клітин для напрацювання певних метаболітів

Клонування клітин в напіврідкому агарі: В основному цей метод використовується для клонування клітин, отриманих із гетерогенної пухлини. В агарі можуть рости клітини з високою ступінню клоногенності. Ефективність клонування залежить від вихідних характеристик пухлин та наявності субпопуляцій стромальних клітин. Вилучення клоногенної популяції із напіврідкого агару методом переносу колоній у звичайні умови культивування в рідких середовищах надає можливість реклонувати клоногенні субпопуляції та застосовувати для подальших досліджень.

-Насьогодні актуальним є отримання стовбурових ембріональних клітин для індивідуального пацієнта. Існують два методи формування ЕСК: метод клонування за допомогою переносу ядер соматичних клітин (ПЯСК, somatic cell nuclear transfer SCNT) епігеномне репрограмування соматичних клітин людини в плюрипотентні стовбурові клітини (induced pluripotent stem cells, iPS). Епігеномне репрограмування плюрипотентності засноване на трансфекції соматичних клітин ретровірусами, які несуть набор із 4 генів Oct4, Sox2, c-myc, Klf4, або Oct4, Sox2, Lin 28, Nanog