Презентація на тему:
Cdks

РЕГУЛЯЦІЯ КЛІТИННОГО ЦИКЛУ ЦИКЛІНЗАЛЕЖНІ КІНАЗИ (CDK)

Регуляція клітинного циклу При вивченні регуляції клітинного циклу було використано результати досліджень трьох груп експериментів: - експерименти, які стосуються злиття клітин - вивчення поділу бластомерів - дослідження мутантів (це в основному стосується клітин-дріждів. 1) Після спеціальної обробки зливали в культурі клітини, які знаходились в двух різних фазах – наприклад G1 та S-періодах. Утворені химерні клітини містили по два ядра, в одному із них на момент злиття відбувався синтез ДНК (S-період) в іншому (G1) –ні. Проте, через короткий період часу синтез ДНК починався і в іншому ядрі.

Після спеціальної обробки зливали в культурі клітини, які знаходились в двух різних фазах – наприклад G1 та S-періодах. Утворені химерні клітини містили по два ядра, в одному із них на момент злиття відбувався синтез ДНК (S-період) в іншому (G1) –ні. В утвореній химерній клітині відбувається синтез ДНК. Відповідно - в S-клітині містяться фактори, здатні дифундувать в ядра G1 –клітин і можуть ініціювать реплікацію ДНК.

Якщо аналогічний експеримент провести з клітинами, які знаходяться в G2 (в якому вже міститься подвоєний набір ДНК) та S- клітини, то результат буде негативним Тобто, в G2 –періоді в ядрах клітин є механізм, який блокує надлишкову реплікацію, навіть при дії стимулюючих факторів Також показові експерименти з М-клітинами, в яких відсутні ядра. Після їх злиття з любими із інтерфазних клітин (G1 G2 S-клітини) у останніх розрушується ядерна оболонка, а хромосоми підлягають конденсації. Це свідчить за те, що в мітотичних клітинах присутні регуляторні фактори, що запускають мітоз.

Дослідження поділу бластомерів. Для цього було використано гігантські яйцеклітини амфібій та морських їжаків, а також утворені із них зародки на ранніх стадіях розвитку. Як відомо, на цих стадіях інтенсивно відбувається мітотичний поділ – всі клітини при цьому діляться одночасно. Все це дозволяє використовувати цей біологічний матеріал для отримання біохімічних білкових факторів, відповідальних за мітоз. Після очистки відповідних субстанцій їх вводять в фракцію ооцитів, які знаходяться в самому початку мейозу. Якщо в отриманому зразку містяться фактори, що запускають поділ, ооцити із стану спокою вступають в мейотичний поділ і перетворюються в яйцеклітину

  Дослідження мутантів. Для зручності в цих експериментах використовують дріжджі, в вегетативній фазі життєдіяльності їх клітини гаплоїдні (містять по одній копії генів), що полегшує виявлення мутацій, які можна індукувати різними способами: опроміненням, нагріванням, хімічними агентами. Подібні мутації порушують клітинний цикл, при якому змінююються розміри клітин. 1.при мутаціях cdc (cell-division-cycle цикл поділу клітин) мутаціях йде блокування поділу клітин, що призводить до їх постійного росту без почкування – формуються гігантські клітини 2. крихітні мутації wee-поділ відбувається до того, як клітина встигла достатньо подовжитись – в результаті утворюються клітини дуже малої довжини. В обох випадках ушкоджуються різні гени, для ідентифікації яких поступають слідуючим чином: -виділяють ДНК із нормальних клітин -фрагментують її за допомогою рестриктаз -включають отримані фрагменти нормальної ДНК в склад різних плазмід -вводять плазміди із досліджуваним фрагментом в мутантні клітини Якщо мутація рецесивна, а введений фрагмент ДНК містить “правильну” версію мутованого гену, то клітинний цикл нормалізується і утворюється колонія клітин звичайного розміру. Таким чином можно досліджувати роль кожного із генів в регуляції клітинного циклу.

Цикліни та циклінзалежні кінази Циклінзалежні кінази (Cdk) - високоспецифічні протеїнкінази, що фосфорилюють певні білки різних фаз клітинного циклу і таким чином активують або інгібують їх. Cdk функціонує в комплексі з цикліном, який не лише активує кіназу, а й визначає її субстратну специфічність. Циклін-Cdk – гетеродимерний комплекс, в якому циклін відіграє роль регуляторної (активаторної) субодиниці, а Cdk – каталітичної.

РЕГУЛЯЦІЯ ЕКСПРЕСІЇ ГЕНІВ CDKS Комплекси G1-періоду (циклін D–Cdk4,6 та циклін Е–Cdk2), окрім інших різноманітних впливів, запускають транскрипцію гену Cdk1. РЕГУЛЯЦІЯ АКТИВНОСТІ CDKS Зв’язування активаторної субодиниці – цикліну. Зв’язування інгібіторної субодиниці. Інгібіторами Cdk є білки двох родин – INK4 (p15, p16) та КІР1 (р21, р27, р57), які перешкоджають активації Cdks. Фосфорилювання/дефосфорилювання Cdks сецифічними кіназами/фосфатазами, що призводить до їх активації чи інгібування.

РЕГУЛЯЦІЯ СИНТЕЗУ ТА РОЗПАДУ АКТИВАТОРІВ ТА ІНГІБІТОРІВ CDKS Синтез циклінів: кінцевою мішенню дії мітогенних факторів часто є ген цикліну D. Розпад циклінів: убіквітинзалежний протеоліз. Циклін В–Cdk1 (MPF) фосфорилює певні білки і стимулює вхід клітини в мітоз, але для завершення мітозу рівень MPF має зменшитись. Це забезпечується наступним чином: під час метафази мітозу MPF фосфорилює, окрім інших білків, фактор APC (anaphase-promoting complex) – убіквітинлігазу, специфічну до MPF. АРС швидко приєднує молекули убіквітину до цикліну В, який після цього швидко руйнується в протеосомі. Синтез інгібіторів Cdks: в деяких регуляторних шляхах білки родини Smad стимулюють синтез р15, р21 та інших інгібіторів, в результаті чого поділи припиняються.

СИГНАЛЬНІ ШЛЯХИ, ПОВ’ЯЗАНІ З CDK Переважна більшість сигнальних шляхів, що регулюють проліферацію клітин, спрямована на комплекси G1-періоду (циклін D–Cdk4,6 та, в меншій мірі, циклін Е – Cdk2). Зовнішній стимул (мітоген) призводить до активації тирозинкінази, асоційованої з рецептором. Наступною ланкою є каскад МАРК, фосфорилювання певних транскрипційних факторів (Elk, Ets, ATF2, Tcf тощо) та активація ними генів ранньої відповіді (FOS, JUN). Fos i Jun – транскрипційні фактори, що активують гени пізньої відповіді, і серед них – гени цикліну D, Cdk4, Cdk6.

РЕЗУЛЬТАТ ВПЛИВУ МІТОГЕНІВ: Підвищення вмісту в клітині цикліну D та Cdk4, Cdk6. Зниження вмісту інгібіторів Cdks. Дефосфорилювання і підвищення активності Cdk4, Cdk6, а також Cdk2. Все це забезпечує накопичення в клітині активних комплексів циклін D–Cdk4,6. Вони починають готувати клітину до поділу.

EGF GRB SOS Ras PAK MEKK Jnk Fos Jun Raf MEKK Erk cD Cdk4 EGFR

ДІЯ АНТИМІТОГЕНІВ TNFα через сигнальні шляхи сфінгозину та РКС інгібує каскад МАРК, в результаті чого в клітині знижується кількість активних комплексів циклін D–Cdk4,6 і поділи припиняються. Водночас через інші сигнальні шляхи TNFα ініціює апоптоз. TGFβ-рецептор фосфорилює і активує Smad2 та Smad3, після чого вони приєднують Smad4 і дифундують в ядро, щоб активувати експресію генів інгібіторів Cdks (p15, p21). Накопичення цих інгібіторів призводить до зупинки проліферації.

РОЛЬ ПОЗАКЛІТИННОГО МАТРИКСУ Більшість клітин можуть ділитися, тільки будучи прикріпленими до позаклітинного матриксу (базальної мембрани, колагенових волокон, поверхні флакона тощо). Інформація про такий зв’язок надходить від інтегринів через тирозинкінази FAK та Src. Субстратом Src є адапторний білок SHC, який передає сигнал на каскад МАРК паралельно з сигналом від рецепторів факторів росту. Тобто для вступу в мітотичний цикл необхідні як сигнал про прикріплення до субстрату, так і мітогенна стимуляція, причому в неприкріпленій клітині активація мітозу блокується.

КОНТАКТНЕ ГАЛЬМУВАННЯ ПРОЛІФЕРАЦІЇ При контакті з навколишніми клітинами проліферація припиняється. Сигнал про міжклітинний контакт надходить від адгезивних білків кадгеринів. При взаємодії з іншою клітиною кадгерин набуває здатності зв’язувати білок β-катенін. У вільній формі β-катенін утворює активний комплекс із транскрипційним фактором Tcf4, який мігрує в ядро і в кінцевому результаті стимулює експресію генів цикліну D та білка Мус (останній активує експресію фосфатази, яка дефосфорилює і активує Cdk4). При міжклітинній взаємодії β-катенін зв’язується з кадгерином, і поділи припиняються.

СИГНАЛЬНІ ШЛЯХИ CDKS: ВИСНОВКИ Для того, щоб розпочався клітинний цикл, необхідне утворення певного комплексу транскрипційних факторів, що активують експресію генів ранньої відповіді. Цей комплекс містить β-катенін та фактор Tcf4 (коли немає міжклітинних контактів), а також фактори, що активуються через каскад МАРК (його повноцінне функціонування можливе при дії ростового фактора та за умови прикріплення клітини до матриксу). Отже, для вступу в мітотичний цикл необхідне виконання трьох умов: відсутність міжклітинних контактів прикріплення клітини до субстрату позаклітинний стимул (ростовий фактор)

ЗАГАЛЬНИЙ ПРИНЦИП ПЕРЕБІГУ ЦИКЛУ Комплекс циклін–Сdk чергової стадії циклу забезпечує: інактивацію комплексу попередньої стадії стимуляцію подій поточної стадії утворення або активацію комплексів наступної стадії Тобто діє своєрідний ланцюговий механізм, в якому кожна стадія процесу готує умови для наступної стадії, причому після проходу точки рестрикції процес іде незалежно від зовнішніх стимулів.

МЕХАНІЗМ ДІЇ КОМПЛЕКСІВ G1-ПЕРІОДУ. АКТИВАЦІЯ PRB Комплекси циклін D–Cdk4,6 фосфорилюють білок pRb та подібні до нього білки р105 та р130. Білок pRb в нефосфорильованому стані інгібує транскрипційні фактори E2F i DP. Після фосфорилювання pRb дисоціює, а комплекс E2F-DP активується і набуває здатності стимулювати експресію цілого ряду генів, серед них: гени циклінів Е, А та Cdk1,2 гени самих факторів E2F (позитивний зворотний зв’язок, самопідтримання процесу) гени ключових ферментів синтезу ДНК (підготовка до S-періоду) гени наступних транскрипційних факторів, що стимулють в кінці G1-періоду синтез цикліну В

МЕХАНІЗМ ДІЇ КОМПЛЕКСІВ G1-ПЕРІОДУ Фосфорилювання та інактивація АРС (anaphase promoting factor) – убіквітинлігази, яка стимулює швидкий протеоліз цикліну В. Як наслідок, рівень цикліну В продовжує зростати до метафази мітозу. Фосфорилювання та інактивація інгібіторів комплексів циклін A–Cdk2 та циклін В–Cdk2. звільнені від інгібуючого впливу комплекси вводять клітину в S-період.

МЕХАНІЗМ ДІЇ КОМПЛЕКСІВ S- ТА G2-ПЕРІОДІВ (ЦИКЛІН А–CDK2, ЦИКЛІН B–CDK1,2) контроль одноразової реплікацї ДНК утворення компонентів MPF (mitosis-promoting factor) – цикліну В та Cdk1 гальмування активності цього комплексу і запобігання передчасному входу клітини в мітоз

ПРОФАЗА ТА МЕТАФАЗА МІТОЗУ: МЕХАНІЗМ ДІЇ MPF (ЦИКЛІН В–CDK1) Конденсація хромосом. MPF фосфорилює гістон Н1 та білки SMS (structural maintanance of chromosomes) з утворенням компактних метафазних хромосом. Розпад ядерної оболонки. MPF фосфорилює білки ядерної ламіни, що призводить до їх дисоціації, при цьому ядерна мембрана розпадається на дрібні везикули. Формування веретена поділу. MPF фосфорилює тубулін з утворенням мікротрубочок веретена. Затримка передчасної цитотомії. MPF фосфорилює легкі ланцюги міозину, що запобігає їх взаємодії з актином і утворенню кільця до того моменту, поки хромосоми не розійдуться до полюсів клітини.

АНАФАЗА І ТЕЛОФАЗА МІТОЗУ: ДІЯ АРС І ПРОТЕЇНФОСФАТАЗ АРС (убіквітинлігаза, що сприяє швидкому протеолізу ряду білків, в тому числі і MPF) фосфорилюється і активується MPF в метафазі мітозу. Маркує до протеолізу білки-інгібітори анафази, що входять до складу центромерних комплексів, які утримують сестринські хроматиди від розходження. Маркує до протеолізу MPF в пізній анафазі. Після цього фосфатази дефосфорилюють білки, що були фосфорильовані MPF в метафазі. Це призводить до відновлення ядерної оболонки, деконденсації хромосом, утворення актоміозинового кільця і цитотомії.

ВИСНОВКИ Клітинний цикл – складний самопідтримуваний процес, який після запуску регулюється внутрішньоклітинними факторами незалежно від мітогенних стимулів. Головними факторами, які регулюють перебіг клітинного циклу, є цикліни та циклінзалежні кінази, які в комплексі фосфорилюють певні білки-мішені, активуючи або інактивуючи їх. Завдяки складній системі позитивних та негативних зворотних зв’язків фази мітозу відбуваються строго послідовно, оскільки ефекторні молекули кожної фази створюють умови для переходу до наступної.