Презентація на тему:
Біохімія печінки. Біотрансформація

БІОХІМІЯ ПЕЧІНКИ. Ч. IV Знешкодження токсичних речовин у печінці

Суть реакцій знешкодження токсичних сполук у печінці Внаслідок низки хімічних перетворень (окислення, віновлення, метилювання, ацетилювання, кон югації з рядом сполук) токсичні речовини перетворюються на менш токсичні або нетоксичні завдяки тому, що новоутворені речовини є більш водорозчинними, ніж вихідні, що посилює їх виведення з організму через нирки Є виняткові випадки, коли утворені водорозчинні речовини стають ще більш токсичними або набувають канцерогенних властивостей

Приклади сполук, які знешкоджуються у печінці Чужорідні речовини (ксенобіотики): - харчові додатки - ліки - пестициди - гербіциди - інсектіциди - косметичні засоби - хімічні продукти побутового користування - промислові отрути Ендогенні токсини: - білірубін - аміак - біологічно активні аміни - продукти гниття амінокислот у кишечнику (індол, фенол, скатол) - токсичні гідрофобні жовчні кислоти

2 фази системи біохімічної детоксикації шкідливих речовин у печінці Детоксикація окремих сполук може включати обидві фази або лише одну із них

2 фази системи біохімічної детоксикації шкідливих речовин у печінці: схема

Реакції модифікації Пов язані з функціонуванням монооксигеназних систем гладенького ЕПР Це реакції окислення (гідроксилювання, введення епоксидної групи, утворення сульфоксидів, дезалкілування, дезамінування), відновлення (карбонільної групи, азо- чи нітросполук, дегалогенування), гідролізу ефірів і пептидів (напр., ацетилсаліцилової к-ти), десульфування) В їх результаті у склад неполярних молекул вихідних речовин вводяться функціональні групи -ОН, -СООН, -SH, -NН2, що збільшує їх полярність

Система цитохрому р450. Мікросомальні монооксигенази Після диференційного центрифугування фрагменти мембран ЕПР утворюють т. зв. мікросомну фракцію (або фракцію мікросом), що лишається в рідині над осадом після видалення важких часток, ядер і мітохондрій. В мікросомах печінки локалізований особливий дихальний ланцюг, що містить ферменти окислення - оксигенази. Оксигенази каталізують реакції введення одного (монооксигенази) чи двох (діоксигенази) атомів молекули кисню в субстрати і потребують присутності донорів електронів НАДН, НАДФН та ін. Для мікросомальної системи гідроксилювання печінки характерними є монооксигенази. Монооксигенази каталізують розщеплення сполук різного типу за участю НАДФН та О2; при цьому один атом кисню приєднується до субстрату, а інший звільнюється у складі молекули води: 2НАДФН + R-H + O2 2НАДФ+ +R-ОН +Н2О, або R-H + 1/2O2 R-OH

Компоненти мікросомальної гідроксилюючої системи цитохрому р450 печінки Компонентами ланцюгів мікросомальної гідроксилюючої системи печінки є: ФАД-вмісний флавопротеїн (НАДФН-цитохром р450-редуктаза), цитохром b5 та кінцева монооксигеназа - цитохром Р-450, а також фосфоліпіди й НАДН-цитохром-b5-оксидоредуктаза: НАДФН ФАД цитохром b5 кінцева монооксигеназа (= цитохром Р-450) НАДФН-цитохром р450-редуктаза здійснює транспорт електронів від НАДФН до цитохрому р450, які необхідні для активації комплексу цитохром р450 з субстратом. Це флавопротеїн, що містить одну молекулу ФАД і одну молекулу ФМН, що не пов’язані з білком ковалентно, на один поліпептидний ланцюг. цитохром Р-450 - пояснення у наступних слайдах фосфоліпіди (головним чином фосфатидилхоліни, беруть участь майже в усіх стадіях мікросомального гідроксилювання, підвищують спорідненість субстрату до ферменту, стабілізують активну конформацію цитохрому Р-450). цитохром b5 НАДН-цитохром-b5-оксидоредуктаза

Система цитохрому р450. Типи реакцій, які каталізують мікросомальні монооксигенази Найбільш поширені реакції гідроксилювання по насиченому вуглецевому атому - окислення аліфатичних сполук, гідроксилювання стероїдів, холестеролу, аліциклічних сполук та алкільних бічних ланцюгів. Монооксигенази також каталізують гідроксилювання ароматичних, гетероциклічних сполук, N-гідроксилювання та N-окислення та ін.

Система цитохрому р450. Цитохром р450 Цитохром р450 (ц/х р450) - найважливіша мікросомальна монооксигеназа, що використовує НАДФН як джерело окисно-відновних еквівалентів В 1958 році Гарфікель та Клингенберг незалежно відкрили гемопротеїн цитохром Р-450; його назва зумовлена тим, що відновлена форма гему зв язує оксид вуглецю (СО) і набуває характерного поглинання світла при 450 нм. Це родина гемопротеїнів з М.м. 50 кД; в різних біологічних системах виявлено понад 300 ізоформ ц/х р450, які різняться за своєю субстратною специфічністю і особливостями первинної структури Цитохром Р-450 бере участь в багатьох стадіях біосинтезу та метаболізму жовчних кислот, стероїдних гормонів, ейкозаноїдів, в утворенні ненасичених жирних кислот Фізіологічне значення існування ізоформ ц/х р450: захист тваринного організму від численних низькомолекулярних ксенобіотиків, що потрапляють у організм. Систему ц/х р450 ще називають “другою імунною системою”, яка є додатковою до основної системи імунного захисту (остання протидіє надходженню в організм чужорідних високомолекулярних сполук біологічного походження) Біосинтез різних ізоформ цитохрому р450 кодується кількома підродинами генів, які у ссавців позначаються як CYP (від англ. cytochrome p450). В геномі людини за синтез всіх ізоформ ц/х р450 відповідають понад 100 генів (CYP1, CYP2, CYP3,...). Клінічний інтерес мають ізоформи ц/х р450, причетні до біотрансформації численних лікарських препаратів, зокрема, CYP1А2, CYP2С8 - 10, CYP2С-19, CYP2D6, CYP2Е, CYP3А4 Окислена форма Р-450 відновлюється і активує кисень. Цитохром Р-450 виконує подвійну функцію - 1) зв’язує субстрат гідроксилювання, 2) на ньому відбувається активація кисню

Схема функціонування мікросомальної гідроксилюючої системи (за R. Estabrook et al) І стадія: взаємодія субстрату з окисленою формою ц/х р450; утворення фермент-субстратної форми при цьому супрводжується переходом гемового заліза із низько- у високоспиновий стан ІІ стадія: відновлення ферментно-субстратного комплексу першим електроном, який надходить від НАДФН за участю флавопротеїну - НАДФН - цитохром Р-450 - редуктази. Передбачають у цьому участь цитохрому в5, що міститься в мембранах ендоплазматичного ретикулуму. ІІІ стадія: утворення потрійного комплексу SH-Fe2+-О2. Кисень приєднується до відновленого фермент-субстратного комплексу з великою швидкістю

Схема функціонування мікросомальної гідроксилюючої системи (за R. Estabrook et al) (продовження) Іv стадія: потрійний комплекс відновлюється другим електроном, який передається з НАД-специфічного ланцюгу переноса, що містить НАДН - цитохром b5 - редуктазу і цитохром b5. Є дані про взаємодію чи спряження двох ланцюгів переноса електронів - НАДФН- та НАДН-специфічного - через цитохром b5. V стадія - складні внутрішньомолекулярні перетворення відновленого потрійного комплексу та його розпад із звільненням гідроксильованого похідного та води

Регуляція активності ц/х р450

Оцінка стану мікросомальної системи Гексаналова проба: у тварин викликають “гексаналовий сон” і реєструють тривалість сну. Зменшення її свідчить про індукцію ферментів, пролонгація - про інгібіцію Антипіринова проба - грунтується на визначенні у сечі вмісту метаболітів антипірину - 4-аміноантипірину й n-ацетил-4-аміноантипірину, які взаємодіють із фенолом і утворюють сполуки типу індофенолу. Посилення метаболізму антипірину свідчить про індукцію монооксигеназної системи, а гальмування - про її пригнічення Захворювання печінки супроводжуються зниженням детоксикаційної функції, що може бути причиною підвищення чутливості до ряду ліків, які біотрансформуються системою ц/х р450

Реакції кон югації Кон югації підлягає більшість ксенобіотиків, що мають функціональні групи, які утворилися в стадії модифікації Кон югація - це енергозалежний процес Значна частина цих реакцій відбувається на мембранах ЕПР, проте деякі з них протікають в цитоплазмі і в інших структурах клітини Найпоширеніші реакції кон югації: - глюкуронідна - сульфатна - кон югація з глутатіоном - кон югація з амінокислотами (глутаміном, гліцином, тощо) - метилювання і ацетилювання Із печінки кон югати виводяться рецептор-залежною екскрецією в жовчні капіляри або через нирки

Кон югація з глюкуроновою кислотою Активною формою глюкуронової кислоти є уридиндифосфатглюкуронова к-та (УДФГК), що утворюється при окисленні УДФ-глюкози НАД-залежною УДФГ-дегідрогеназою: УДФГ +2НАД УДФГК +2НАДН2 Загальна реакція глюкуронідної кон югації: R-OH + УДФГК R-О-глюкуронід + УДФ (фермент - УДФ-глюкуронілтрансфераза) В залежності від хімічної природи субстрату - О-, N-, S-глюкуронування: R-NH2 +УДФГК R-NH-глюкуронід +УДФ R-SH + УДФГК R-S- глюкуронід +УДФ Характерна для чужорідних сполук, спостерігається у білірубіну, тироксину і естрадіолу, продуктів гниття білків у кишечнику

Приклад реакції кон югації з глюкуроновою к-тою

Кон югація з сірчаною кислотою Активна форма сірчаної кислоти, що використовується в реакціях кон югації - 3 -фосфоаденозин-5 -фосфосульфат (ФАФС) Ферменти, що здійснюють ці реакції - сульфотрансферази Загальна реакція сульфатної кон югації: R-OH + ФАФС R-OSO3H +ФАФ Сульфатній кон югації підлягають стероїдні гормони і продукти їх метаболізму, продукти гниття білків у кишечнику (фенол, скатоксил, індоксил, крезол), сторонні речовини

Кон югація з глутатіоном Глутатіон - це трипептид гама-глутамініл-цистеїніл-гліцин В основі - здатності глутатіону вступати до реакції кон югації зі сполуками, які містять електрофільні атоми вуглецю, здатні реагувати з -SH-групами за участю глутатіон-S-трансфераз (ГТаза) Механізм. Спочатку ГТази каталізують взаємодію субстрату (R-X, де Х = -ОН чи ін. група) з відновленим глутатіоном (глутатіон-SH): R-X +глутатіон-SH R-S-глутатіон +ХН (R-S-цистеїн-гліцин-глутамат) Від глутатіонового кон югату далі відокремлюються послідовно глутамінова к-та і гліцин з утворенням кон югатів з цистеїном, які виводяться через нирки або перетворюються у меркаптурові кислоти, які теж виводяться із сечею Цим шляхом знешкоджуються сторонні речовини, різні за структурою, а також - у невеликій к-ті - білірубін, естрадіол, простагландини і лейкотрієни

Кон югація шляхом ацетилювання Таким чином знешкоджуються сторонні ароматичні аміни, ароматичні амінокислоти, сульфаніламідні продукти Загальна схема: R-NH2 +CH3-CO-SKoA R-NH-CO-CH3 +KoA-SH ацетил-КоА

Кон югація шляхом метилювання Цей тип кон югації характерний для амінів, фенолів, тіолових сполук, неорганічних сполук сірки, селену, ртуті, срібла, катехоламінів (адреналін, норадреналін), вітаміну РР Донором метильної групи виступає S-аденозилметіонін Ферменти реакції - метилтрансферази Загальна реакція: R-ОН +S-аденозилметіонін R-O-CH3 +S-аденозилгомоцистеїн

Кон югація з амінокислотами (гліцином) і аміноетанолсульфатом (таурином) Кон югація з гліцином характерна для ароматичних і гетероциклічних карбонових кислот, здійснюється у 2 стадії: І стадія: утворення КоА-похідного сторонньої карбонової кислоти (напр., бензойної): ІІ стадія: пептидна кон югація з амінокислотою гліцином: Кон югація з таурином СООН +АТФ +КоА-SH СО-SКоА +АМФ +ФФн СО-SКоА + Н2N-СН2-СООН CO-NH-СН2-СООН +КоА-SH

Найважливіші реакції кон югації, що застосовуються для оцінки стану детоксикаційної функції печінки Проба Квіка-Пителя: після навантаження бензоатом натрію у сечі визначають вміст утвореної гіпурової кислоти. Введений в організм бензоат натрію взаємодіє з ендогенним гліцином з утворенням гіпурової кислоти: При паренхіматозних ураженнях печінки цей показник знижується Визначення екскреції тваринного індикану - сполуки, що утворюється в печінці на основі індолу. Індол є похідним L-триптофану і синтезується в товстому кишечнику під впливом ферментів мікроорганізмів в процесі гниття білків у кишечнику. Утворення тваринного індикану шляхом реакції сульфатної кон югації відбувається за схемою: L-триптофан індол індоксил індоксилсульфат тваринний індикан (це К-сіль індоксилсульфату)

Біохімія печінки. ч.V. Сироваткові ферменти, важливі для діагностики захворювань печінки. Дослідження функціонального стану печінки за синдромним принципом

Екскреторні ферменти Лейцинамінопептидаза (ЛАП) Лужна фосфатаза (ЛФ) (ізофермент, специфічний для печінки; інші ізоферменти - плацентарний, кістковий, кишечний, нирковий). Каталізує гідроліз складноефірних зв язків у моноефірах фосфорної к-ти і органічних сполук. Різке збільшення активності спостерігається за умов механічної жовтяниці, менщ виражене - при гепатиті і цирозі; часом підвищення активності ЛФ є майже єдиною ознакою злоякісних новоутворень печінки Гама-глутамілтранспептидаза (= гама-глутамілтрансфераза) - каталізує перенос гама-глутамілового залишку з гама-глутамілпептиду на акцепторний пептид чи L-амінокислоту. Збільшення її активності завжди пов язане з ушкодженнями печінки: при холестичних станах (паралельно із ЛФ), при прийомі деяких антисудомних ікарських препаратів та алкоголю, за алкогольного гепатиту (застосовують як тест на хронічний алкоголізм) .

Секреторні ферменти Прокоагулянти (зокрема, фібриноген, протромбін, проакцелерин і проконвертин, антигемофілічні фактори) - тому одним із найцінніших прогностичних показників є визначення протромбінового часу (це проба на зсідання крові), а також вміст прокоагулянтів у плазмі крові Холінестераза печінки (ін. назва - псевдохолінестераза, ХЕ) - здійснює розщеплення ефірів холіну (ацетилхоліну, бензоїлхоліну, сукцинілхоліну тощо) за схемою (для ацетилхоліну): СН3СООСН2СН2N+(СН3)3 + Н2О СН3СООН + НОСН2СН2N+(СН3)3 ацетилхолін оцтова к-та холін Зниження активності ХЕ в сироватці крові відображує тяжкість і поширеність клітин печінки за гострого гепатиту, цирозу, онкологічних захв-х печінки. Показник важливий для спостереження за протіканням хвороби і для прогнозу хронічних захворювань печінки Церулоплазмін (мідна оксидаза) - основна оксидаза плазми крові, яка належить до групи білків гострої фази. Вона здійснює транспорт міді для синтезу супероксиддисмутази і цитохромоксидази; регулює рівень біогенних амінів, у т.ч. катехоламінів; стимулює фагоцитарну і бактеріцидну активності нейтрофілів і моноцитів; є ферроксидазою - окислює Fe++ до Fe+++, який здатний вбудовуватися у трансферин і в такий спосіб транспортуватися у кістковий мозок. Зменшення його вмісту - при недостачі синтезу печінкою (некроз печінки, хвороба Вільсона або гепатолентикулярна дегенерація). Рівень ЦП значно зростає за різних інфекційних захворювань (це білок гострої фази), у т.ч. за гепатитах.

Індикаторні ферменти Трансамінази: АлАТ і АсАТ. В нормі співвідношення АсАТ до АлАт (коефіцієнт де Рітіса) = 1,3 - 1,4. При жовтяничних та безжовтяничних формах гострого гепатиту, некрозі печінки, лікарських її ураженнях, за вірусного гепатиту, метастазах у печінці, гепатомах, інфекційного мононуклеозу, при цирозах печінки і хрон. гепатитах в періоди загострень збільшується активність трансаміназ, особливо АлАТ (тобто коефіцієнт де Рітіса стає нижчим за норму). За алкогольного гепатиту виразніше зростає АсАТ. Максимальна активність цих ферментів - при переході хрон. гепатиту в цироз. Альдолаза (фруктозо-1,6-дифосфатальдолаза) - гліколітичний фермент, що міститься у скелетних м язах і печінці та каталізує обернену реакцію: фруктозо-1,6-дифосфат діоксиацетонфосфат + гліцеральдегід-3-фосфат При ураженні зазначених органів з являється у великій кількості у крові. Її активність зростає у преджовтяничному періоді хвороби Боткіна через активацію вірусом перших етапів процесу гліколізу. Фруктозо-1-фосфатальдолаза - каталізує наступну реакцію: фруктозо-1-фосфат діоксиацетонфосфат + гліцеральдегід Визначення активності фермента служить специфічним показником ушкодження паренхіми печінки. В десятки разів зростає при гострому гепатиті, в 2-3 рази - за токсичного ураження печінки. При новоутвореннях і захворюваннях жовчовивідних шляхів цей показник не змінюється ЛДГ - гліколітичний фермент, що каталізує реакцію перетворення лактату на піруват: лактат + НАД піруват + НАДН Є 5 ізоформ цього ферменту, що відрізняються за субодиничним складом (М-с/о і Н-с/о, від muscle і heart): ЛДГ1 (Н4) і ЛДГ2 (Н3М) - в серцевому м язі, ЛДГ3 (Н2М2) - в легенях, селезінці лімфовузлах, ЛДГ4 (НМ3) і ЛДГ5 (М4) - в печінці і скелетних м язах. За гострого гепатиту різко зростає активність печінкових форм (в 6-8 разів) і зменшується - двох перших. ЛДГ5 зростає при цирозі, всіх типах гепатиту, пасивному застої у печінці. В нормі у сироватці: ЛДГ1 -31%; ЛДГ2 - 40%; ЛДГ3 - 17%; ЛДГ4 - 8%; ЛДГ5 - 4%

Дослідження функціонального стану печінки за синдромним принципом На основі патоморфологічного принципу розрізняють низку синдромів, пов язаних зі змінами активностей ряду ферментів: - синдром цитолізу - синдром холестазу - синдром гепатоцелюлярної недостатності - мезенхімально-запальний синдром - синдром регенерації і пухлинного росту - синдром шунтування печінки

Синдром цитолізу (порушення цілісності гепатоциту) У сироватці крові зростають активності: - АсАТ і АлАТ - ЛДГ - фруктозо-1-фосфатальдолази - гамаглутамілтранспептидази - орнітилкарбамоїлтрансферази - сорбітолдегідрогенази - глутаматдегідрогенази

Синдром холестазу в сироватці крові зростають активності: - ЛАП; - гама-глутамілтранспептидази - ЛФ - КФ (кислої фосфатази) - 5 -нуклеотидази Також зростає вміст ЖК, білірубіну (загального за рахунок кон югованого), холестеролу крові

Синдром гепатоцелюлярної недостатності Одна з основних ознак - зниження у сироватці крові активності холінестерази. Іншими індикаторами є: - бромсульфалеїнова і вофавердинова проби - антипіринова і кофеїнова проби - проба Квіка-Пителя - тести на прокоагулянти (фібриноген, протромбіновий індекс, проакцелерин і проконвертин, антигемофілічні фактори), вільний гепарин - дослідження вмісту альбумінів сироватки крові, альфа-1-антитрипсину, церулоплазміну

Індикатори мезенхімально-запального синдрому Синдром пов язаний із пошкодженням мезенхіми і строми печінки (фіброзна оболонка +портальний тракт +внутрішньопечінкова сполучна тканина) Основні індикатори: - гама-глобулін сироватки крові - осадові реакції (тимолова і сулемова проби) - імуноглобуліни A, G, M, D сироватки крові - вміст продуктів обміну сполучної тканини (оксипролін плазми крові й сечі, проколаген-ІІІ-пептид (=проколаген печінки))

Індикатори синдрому регенерації і пухлинного росту При пухлинах, зокрема, при гепатоцелюлярній карциномі, у сироватці крові з являється альфа-фетопротеїн

Індикатори синдрому шунтування печінки До них належать речовини, які в нормі головним чином надходять із кишечника у систему ворітної вени і в печінку: - аміак та його похідні - феноли - амінокислоти тирозин, фенілаланін, триптофан, метіонін - жирні кислоти з коротким ланцюгом В патологічних умовах, при розвитку венозних колатералей, ці сполуки потрапляють у систему загального кровотоку, не надходячи до печінки, і стають показником викиду венозної портальної крові. Шунтування печінки таким чином спричиняє кишкову інтоксикацію.